在潮湿的条件下，微生物在各种材料上生长，包括金属、无机矿物和有机聚合物。188金宝搏bet官网¹作为生物膜的微生物及其胞外多糖的复杂群落是底层材料腐蚀和/或变质的先决条件。188金宝搏bet官网^2、3这影响了具有巨大经济价值的金属结构，如桥梁和管道;燃气输电线中70%的腐蚀是由于微生物引起的问题。^4、5金属结构一般采用防腐涂层进行保护，但这些涂层上的生物膜会导致起泡和附着力损失，导致保护系统失效。⁶

丝状真菌被认为是引起漆膜破坏最严重的微生物。⁷它们是真核微生物，具有广泛的营养相网络(菌丝体)，释放酶，糖蛋白和有机螯合剂。⁸因此，它们积极参与腐蚀过程，因为它们可以通过化学降解和差异曝气和裂纹区域来修饰它们生长的基质。^4、9从这个意义上说，局部腐蚀与真菌菌丝存在空间关系。¹⁰真菌在很大的pH值范围内生长，是最耐干燥剂的微生物，在对细菌来说过低的湿度水平下仍保持活性，并形成耐干燥剂的孢子。^11、12真菌影响腐蚀(FIC)可以定义为真菌参与启动、促进或加速腐蚀反应的电化学过程。⁴因此，基材的金属保护需要更全面地考虑使用特殊涂层来防止其FIC，同时考虑到保护系统的真菌敏感性，以防止未来导致效率损失的故障。

本工作利用电化学技术(腐蚀电位和离子电阻)对不同防腐涂层上的真菌恶化进行评估。首先，采用常规微生物技术从生物降解的漆膜中分离出真菌。最常见的和恶化的真菌，与研究的主题，被选择和鉴定。鉴定基于微观和宏观形态观察。^13、14对分离菌株进行了分子分析，以支持其鉴定。

本属选定的真菌曲霉属真菌(H1)和青霉菌用(H2)接种评价漆膜。研究了含各种防腐蚀颜料(磷酸锌和稀土离子改性沸石)的涂料和不含防腐蚀颜料的涂料。应该考虑到，在过去，用铬酸锌配制的涂料可以防止微生物的生长，而且相当耐变质。⁶由于铬酸盐的高毒性及其后续的禁用，新型防腐颜料被广泛研究。使用稀土金属(REM)阳离子(如铈或镧)改性的扩展剂颜料可能构成磷酸盐的替代品，因为它们被发现具有优异的抑制性能，可以被认为是“绿色”抑制剂。^15—

接种样品和相应的对照放置在容器内，以调节内部相对湿度。¹⁹两个月后，在接种试验基底上进行电化学测量。结果表明，电化学技术可用于区分不同真菌种类对防腐涂料的降解活性。

188金宝搏bet官网材料与方法

真菌的分离、鉴定及分子分析

从拉普拉塔市(34º54’s和57º55’w)采集生物降解漆板样品，用生理溶液(PS)稀释。100L的稀释液在以玫瑰孟加拉菌为基础的培养基(BR) (2.0 g琼脂，2.5 mg玫瑰孟加拉菌，1.0 g葡萄糖，0.5 g蛋白胨蛋白酶，0.1 g KH)的平板上接种₂阿宝₄， 0.05 g MgSO₄.7H₂O和蒸馏水至100毫升)。此外，为了防止细菌生长，在培养基中添加了抗生素。BR在不影响孢子萌发的情况下限制菌落的传播。这些板在28°C下孵育至少72小时，然后用常规微生物技术分离真菌。¹³

根据真菌的微观和宏观形态特征，使用标准分类键进行鉴定。^13、14为了改进分离株，对其进行了微培养观察和棉蓝染色。选择了最常发生和恶化的真菌。

选择的真菌通过PCR (Macrogen-Korea)扩增ITS区域直接测序进行分子分析，以确认鉴定。^20.所用引物为ITS1(5´-TCC GAT GGT GAA CCT GCG G-3´)和ITS4(5´-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3´)。使用GenBank数据库进行Blast搜索，对序列进行分析²¹来揭示最接近的已知类似物。

为了评估其降解活性，分离出的真菌在与之前相同的BR培养基上生长，但没有添加0.1% w/v CaCO的玫瑰孟加拉_3.28℃孵育7天。菌丝体周围形成的光晕证明了真菌对酸的释放。

涂料的配方和制备

防腐蚀颜料的选择

选用了三种不同的防腐颜料。一种是传统的磷酸锌，另一种是它的替代品——镧交换沸石。磷酸锌引起了一些环境问题，因为磷酸盐会导致水道富营养化，而锌本身是有毒的，所以正在寻找替代品。另一方面，铈和镧交换沸石正在作为替代无机绿色抑制剂进行研究，沸石是一种天然矿物，镧系离子的毒性小于钠。¹⁵这些颜料的制备方法已在别处详细介绍。^17、18

涂料配方、制备及应用

表1显示了油漆成分。在所有情况下，防腐颜料的含量相对于颜料混合物的总体积为30%。这个值通常被推荐用于磷酸盐颜料。^{22 - 24}所用的防腐蚀颜料有:磷酸锌(PZ20, SNCZ)、改性Ce(III)离子沸石(ZCe)和改性La(III)离子沸石(ZLa)。这两种交换沸石都是在实验室制备的。¹⁷配制并制备了非防腐颜料涂料。颜料配方由硫酸钡、二氧化钛和滑石粉完成。加入中油溶剂型醇酸树脂(Alkypol 434/50)，使PVC/CPVC比值(颜料体积浓度/临界颜料体积浓度)保持在0.7，以矿物油为溶剂。使用了不同的添加剂:润湿分散剂(TEGO 652, 1% v/v)，基材保湿剂(TEGO 270, 1% v/v)，整平剂(TEGO 270, 1% v/v)，钴- (Casal del Rey, 0.06% v/v)和钙基干燥剂(Casal del Rey, 0.12% v/v)。

在所有情况下，油漆都是在球磨机中制备的，^{25日,26日,17岁}允许颜料在载体(溶剂和树脂)中分散24小时，直到达到可接受的分散程度(Hegman等级5级)。

SAE 1010 (15.0 x 7.5 x 0.2 cm)钢板喷砂至Sa 2½级(SIS 05 5900标准)，用甲苯除油并涂上配方涂料。干膜厚度为80±10 μm，在实验室环境(20±2℃，相对湿度65%)中放置7天。

电化学方法对真菌生物降解的评价

采用了与E. Juzeliunas等人2007年使用的方法类似的方法。¹⁹首先，将所选真菌在br培养基中培养，在28°C下培养15天，制备所选真菌悬液。分生孢子浓度为10⁵/mL用Neubauer室调节。悬浮液的组成为:5.0 g NaCl, 1.0 g HK₂阿宝₄， 1.0 g (NH₄) H₂阿宝₄， 1.0 g (NH₄）₂所以₄， 0.2 g MgSO₄， KNO 3.0g_3.，每1000毫升蒸馏水含0.05克吐温20。

在每块板上建立3个培养细胞，间隔3厘米²圆形区域涂上丙烯酸管(7.0厘米高)。用杀菌剂紫外灯(Philips, 20W)照射这些细胞每面40分钟，并用100µL真菌悬液接种。对照组为100 μ L无真菌孢子的无菌溶液。样品在容量为5l的环境室(EC)中，加入1L饱和K₂所以₄溶液保持相对湿度在97%。然后，在25±2°C的实验室条件下关闭并保持2个月，然后进行相应的电化学测量。为了防止污染，我们使用了三个室，一个室装有对照样品，另一个室装有每一种选定的真菌。时间是根据书目数据规定的，并考虑到对所用方法的初步评价。¹⁹

通过测量漆膜的离子电阻和涂漆基材的腐蚀电位来评估真菌的恶化情况。这些变量的选择考虑到涂层的金属保护是由屏障效应和由于活性色素的存在而产生的防腐作用提供的。^-离子电阻的测量是研究屏障效应的一个很好的工具，因为由于孔隙的存在或涂层渗透性的增加，离子电阻会随着水的进入而减小。阻隔作用延缓了水的进入，但是，一旦水到达金属表面，抗腐蚀色素的作用是主要的保护作用。²⁸

用ATI Orion导体模型170在1000hz频率下测量涂漆钢基板和铂电极之间的电阻。用高输入阻抗电压表对饱和甘汞电极(SCE)监测腐蚀电位。在测量之前，丙烯管中填充10 mL PS，用作电解质。

测量后，用移液管从靠近漆膜的上清液中取样，并镀上BR(不含孟加拉玫瑰)，以验证对照样品中缺乏微生物生长，以及在其他情况下在试验开始时接种的真菌生长。

扫描电子显微镜观察

样品在EC中暴露2个月后，用扫描电镜观察。工作条件为低真空(10^－2-1 Torr)，显微镜是飞利浦FEI Quanta 200。观察条件建立在这类样品不需要脱水就能保持其自然形态的基础上。

用镊子从面板上去除油漆，扫描电镜也观察到了下面的金属。

结果与讨论

真菌的分子分析与鉴定

选择发现的最常见和最恶化的真菌并进行分子分析。图1a和c显示所选菌株在BR中培养1周。通过光学显微镜观察到的一些微培养如图1b和d所示。在这些图像中，分生孢子具有与属相对应的特征形式曲霉属真菌而且青霉菌¹³，¹⁴可见。两种情况下也观察到球形分生孢子。从属中分离出来曲霉属真菌是最频繁的，和青霉菌是否是由于在BR中添加0.1% w/v CaCO时释放了大量的酸性化合物而导致恶化更严重_3.．在培养周结束时，由于释放的酸与CaCO反应，菌丝体周围形成了晕_3.，如图1e所示。这让人想到它对金属的腐蚀潜力。

从分离菌株中选择进行生物测定的核糖体DNA序列的ITS区域通过在NCBI数据库中可用的序列进行Blast搜索进行分析。根据GenBank数据库ITS序列最接近的匹配结果，真菌鉴定结果为来自烟曲霉属真菌而且青霉菌公社登录号为AB976023.1和HQ652873.1，与已知种相似度分别为97%和98% (E=0)。形态分析支持NCBI序列数据的鉴定。所获得的序列已存入GenBank数据库，分离真菌的登录号为KU936230和KU936231。答:来自烟而且p .公社，分别分配。

电化学方法对真菌生物降解的评价

在试件孵育期后，进行相应的电化学测量。图2a和b分别显示了离子电阻(Ri)和腐蚀电位(Ec)的测量值。

可以观察到，离子电阻和腐蚀电位值在所有涂料中都有相同的趋势。对照登记的Ri值在10之间⁶和10⁷Ω疲倦²而对于与之接触的油漆答:来自烟Ri值降低了一个数量级以上(10^3.和10⁵Ω疲倦²)，与之接触的油漆含量甚至更低p .公社（10^3.和10⁴Ω疲倦²)．所有涂漆的面板的腐蚀电位值，一般来说，与对照相比，接种的面板更负。

对照组中Ri和E的差异是由于防腐蚀颜料所提供的保护作用不同。^17日,30这些结果表明，本研究中使用的真菌的存在通过降低漆膜的屏障能力(由于菌丝的渗透和促进水的进入或增加渗透性，在油漆中产生孔隙和打开通道)来修饰漆膜，并加速腐蚀过程的开始，因为水容易渗透涂层，更快地到达金属基底。此外，真菌释放的酸增强了腐蚀。³¹

从每个样品中提取PS，在28ºC下电镀并孵育48小时，结果显示接种后的涂料在所有板上都呈现阳性结果(观察到生长)，而对照涂料(未接种)在预先设定的条件下暴露2个月后呈阴性结果(无生长)。这些结果与离子强度和腐蚀电位的测量结果一致，因为在没有观察到真菌生长的面板(对照组)中，记录了更高的电阻值和更正的腐蚀电位。

最低的Ri测量值和最负的Ec值记录在接触的面板上p .公社这表明这种真菌对所研究的油漆的恶化作用更大。这一结果与用碳酸钙得到的结果一致_3.，显示了更恶化的活动。

扫描电子显微镜观察

图3、4、5和6显示了未接种(a)油漆面板(分别使用油漆1、2、3和4)和另一个接种的扫描电镜显微图p .公社相同配方(b) 2个月后。此外，可以观察到接种去除涂料后暴露的金属基材的显微照片。

在未接种的底物上，没有观察到真菌生长，正如预期的那样，在所有情况下。所有接种的涂料都出现了一定程度的真菌发展，与其他涂料相比，涂料2和涂料3的真菌发展较低(图4和图5)。在对照涂料上观察到最丰富的生物膜(图3b)，特别是在涂料4上，这表明真菌发育程度很高，有大量的特化繁殖菌丝和分散的分生孢子(图6b)。这种油漆比其他油漆劣化程度更严重。可以看到接种真菌的侵袭性生长穿过漆膜，直到到达金属基底，在那里可以看到丰富的菌丝体和分生孢子(图6c)。这些显微镜观察结果与测量的离子电阻值一致，是所有测试画作中最低的。

结论

通过分子方法分离和鉴定频繁恶化的真菌标本是可能的，答:来自烟(KU936230)和p .公社(KU936231)的涂层样品放置在拉普拉塔市。

电化学测试表明，涂层的离子电阻降低答:来自烟而且p .公社，除含有30%铈离子交换沸石的涂料外，腐蚀电位趋于负值较多。

真菌生长在接种油漆面板上可以观察到(宏观和微观)。这些结果与电化学测量的记录值一致。

利用电化学技术可以评价真菌生物膜在涂漆钢基体上引起的生物劣化。

考虑在防腐涂料配方中添加杀菌剂是合适的。

欲了解更多信息，请发送电子邮件至c.deya@cidepint.ing.unlp.edu.ar。

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