目前有超过5000种抗菌产品，基于大约275种不同的活性成分，在美国市场上注册和销售。这些抗菌农药几乎都是有机化学物质，通过杀死(生物杀灭)或灭活微生物(生物抑菌)起作用。抗菌农药在与公共卫生有关的产品(用于控制那些对人类有传染性的生物)和与公共卫生无关的产品(如涂料、金属加工液和木材支架中的保鲜剂)中具有广泛的应用。
与抗菌素类别重叠的是那些被认为是生物农药的材料，它们是天然材料，如植物产品(如菜籽油)、细菌(如荧光假单胞菌188金宝搏bet官网A506)和某些矿物质/金属(如硫或银)。截至2005年底，美国环保署注册的生物农药中约有232种有效成分和1057种产品。生物农药通常被认为比传统农药对人类和环境更安全，其已知的优势通常包括作用范围窄、环境持久性有限和特定的作用模式。虽然这些特性可能限制对人类或环境造成意外后果的风险，但它们也可能需要多次施用、更高的初始浓度/剂量或使用多种农药来达到所需的保护程度。控制微生物害虫的努力每年产生的经济影响约为10亿美元1(以用于抗微生物农药的费用计算)。
生物“绿色”方法:抗菌肽
Reactive Surfaces, Ltd.面临着将生物来源的抗菌肽引入表面涂层的挑战，特别是如何最好地保存涂层中这些生物分子的抗菌性质。在其另一个生物工程添加剂平台上，该公司开发了这种涂层的酶活性5-7，因此有知识可以进行尝试。该任务是识别抗菌肽，将保留其生物杀灭活性的涂层;确定可以相对经济地制造的肽;根据实际的涂层环境对其进行必要的修改;开发允许快速通量测试的技术;并在ProteCoat溶液的开发过程中测试各种涂料中的添加剂和对各种目标微生物的抑制作用。在这个由两部分组成的系列文章中，我们描述了概念目标、实验方法和初步的概念验证实验，证明了在涂料中使用ProteCoat作为生物杀灭添加剂的可行性。本系列的第二部分(2006年10月)将介绍各种涂料的效果，单独使用ProteCoat或与现有的杀菌剂联合使用，以及针对各种目标微生物的效果。此外，涂料和多肽的工程，以最大限度地提高生物杀灭效果将被描述。
人们认识到，人类和大多数其他多细胞生物都相对友好地生活在微生物海洋中，这一认识促进了对新型抗菌剂的探索。从这个角度来看，考虑到人体内大约有1013个细胞和1014个细菌。虽然大多数微生物生活在大肠中，但皮肤上每平方厘米约有103-104种微生物，并且生活在鼻子、嘴巴、胃和小肠中种类繁多。过去20年的分子生物学研究表明，一茶匙土壤中可能有多达4000 - 13000种不同类型的微生物，一茶匙海水中可能有500 - 5000万种。为了保持这种优势，人体及其共生的微生物种群产生了一系列化合物，包括细菌素、防御素和其他阳离子肽，所有这些都能将入侵的微生物拒之门外。抗菌肽(AMPs)存在于粘膜表面(鼻咽、呼吸等)、体表和吞噬细胞颗粒内。除其他来源外，已从蚕蛾、青蛙、人类、马蹄蟹、蝎子、猪、植物、猴子、萝卜、果蝇和蜜蜂中鉴定和鉴定了它们，它们为下一代“绿色”生物杀虫剂提供了模板。
虽然由于这些amp的广泛多样性和通用功能，很难对其进行严格的分类，但它们通常具有物理特性。一般来说，多肽是自然界中由生物合成的化合物(称为氨基酸)聚合形成的分子家族。氨基酸是生命的基本结构构建单元之一，因此，所有已知的生命形式都可以合成或清除氨基酸聚合物，以产生我们所知的蛋白质和多肽(图1)。多肽通常根据长度与蛋白质区分开来，在生命系统中发挥广泛的功能。例如，抗利尿激素是一种由九种氨基酸组成的信号肽，存在于人类和其他生物体内。它的释放是对身体缺水信号的反应，并通过使肾脏减少尿量来保存水分。我们更熟悉的一种肽是胰岛素，它由21个氨基酸和30个氨基酸组成的两条肽链组成，负责维持血糖水平。
一般来说，这些阳离子多肽具有各种各样的序列和结构。然而，也有一些共同的特征，每一个特征都对设计ProteCoat添加剂的活性成分多肽至关重要。天然阳离子多肽长度一般为12-50个氨基酸，具有净正电荷，并含有约50%的疏水氨基酸。由于单个氨基酸之间存在内部相互作用或与膜接触，它们具有三维结构或折叠。然而，阳离子肽的折叠(二级结构)和它们的氨基酸序列(一级结构)，即使在给定的一类二级结构中，也是相当不均匀的。这四种结构类型包括具有两种或两种以上分子间相互作用的b层分子(半胱氨酸残基之间的二硫键)，插入膜时折叠成两类a螺旋的线性分子，扩展分子，以及由一个二硫键控制的环结构。b-薄片和a-螺旋分子是迄今为止自然界中最常见的(图2)。
商业途径及可行性
随着自然产生的amp的数量不断增加，通过使用合成肽，对其作用模式和作为治疗剂的潜力进行了详细的检查。例如，合成肽化学被用于建立最初从巨型蚕蛾中分离出来的天蚕素的主要序列，并开发更活跃、稳定和具有更广泛活性谱的合成类似物组合化学是用于生成多肽的合成化学的产物，诞生于20世纪80年代初，当时Mario Geysen9通过同时合成多种多肽创建了第一个组合库。组合合成方法的使用使大量分子的合成比传统合成化学更快，成本更低。组合库的使用也提供了一种识别新函数的有效方法。多肽家族是可用的(在活性表面的概念验证研究中使用这些肽家族的许可得到了圣地亚哥NCE制药公司的许可)，这些多肽家族是由合成多肽组合库(SPCL)开发的。通过对SPCLs的系统评估，已经鉴定出对丝状真菌有活性的生物活性肽。NCE制药公司的多肽是新颖的(在美国和国外获得专利)，可生物降解，对孢子微生物有很高的功效，对真菌和微生物病原体有活性，对人类、动物或环境没有毒性。10,11由于通过红细胞裂解来评估，对人体的毒性似乎受到多肽长度和疏水相互作用强度的影响12，因此目标多肽的设计模板只有6个残基。这增加了进一步的经济优势，因为组合合成之后的筛选和选择过程可以限制为5次迭代这一迭代过程导致20-100倍的抗菌活性增强，这取决于目标生物(表2)。正如预期的那样，这些肽不裂解红细胞，也没有诱变作用
细胞膜的完整性可以使用荧光染色剂进行评估，如SYTOX Green。SYTOX绿色染色剂是一种高亲和力的核酸染色剂，它不穿过活细胞的膜，但很容易穿透膜受损的细胞。通过SYTOX Green的局部外观可以看出，经乙醇处理的孢子(图3A，微孢子)和菌丝(图3C)细胞膜受损，但它们的DNA仍被隔离在细胞核中。对于用六肽处理后用SYTOX Green观察到的分生孢子(图3B)和菌丝(图3D)，染料弥漫在整个细胞中，表明细胞和核膜已经受损。我们观察到的经验是，在这些研究中使用的所有amp都能够在5分钟内破坏暴露的细胞膜，从而快速杀死用于挑战涂层表面的孢子和营养细胞。
在过去，获得这些小的阳离子肽的唯一方法是从宿主生物中分离出来，这需要大量的材料，只能产生非常少量的肽，或者通过化学方法合成它们。目前可用的一种替代方法是使用生物生产过程来生成肽。发酵方法(用于肽生产，十多年前已成功证明)肯定是最经济的，正如Reactive Surfaces, Ltd.的其他生物工程添加剂(OPDtox™，见PCI, 2005年2月，第26-33页)所证明的那样。amp已通过几种遗传/生物学方法成功表达，包括作为融合蛋白、包涵体、重复/多聚体或细胞表面表达的生产。在生物表达系统中生产这些多肽的优势包括:(1)系统可以相对容易地扩大;(2)成本效益，以及(3)制造变体和利用优化的分离程序的能力。通过开发和生产自然界中存在的活性肽，可以使用现有的发酵技术生产肽，将生产成本降低到可接受的商业水平。
话虽如此，大规模合成肽生产的市场也在迅速增长，这是由于对各种抗菌/抗真菌肽的工业需求，对人类和动物治疗肽的制药需求，以及它们在化妆品和营养补充剂中的使用。这种大规模的多肽化学生产可以通过多种方式实现:固相合成或液相合成。在生产研究用(克)量的抗菌肽成本过高的情况下，生产公斤量的抗菌肽在商业上是可行的。虽然肽的实际序列、长度和任何修改都将对生产成本产生巨大影响，但优化的合成工艺将进一步大幅降低大规模肽合成的成本(个人通信，21世纪生物化学，J. Fishman，博士)。
ProteCoat™:生物工程肽添加剂，适用于涂料
为了评估抗菌肽作为生物杀灭涂层成分的概念，对上述初步研究中描述的六肽进行了进一步的设计考虑，从而得到了成分和活性相似的七肽AMP-7 (NCE制药公司)。为了评估ProteCoat添加剂添加到涂料中时的功效，将一系列ProteCoat稀释剂添加到UCAR 451(陶氏化学)中，这是一种透明的苯乙烯-丙烯酸乳胶。ProteCoat(版本。将NCEP-AMP-7)溶解在UCAR 451中，并将ProteCoat-UCAR涂层涂在96孔透明聚苯乙烯板的底部，然后用104孢子/ml的番茄枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)接种物挑战。随后将孢子转移到生长介质中，在25ºC下生长48小时。如预期的那样，掺合的ProteCoat的MIC大于肉汤中肽成分的MIC，涂层中的生长抑制模式确定了MIC为1.17 mg/ml。在24小时的时间点，即使在测试的最低肽浓度(0.78 mg/ml)下，也有明显的生长迟滞(尽管存在如此高的孢子挑战，但在48小时时，ProteCoat浓度被淹没，抑制最终小于10%)。如前面讨论的，使用膜不渗透荧光染色SYTOX Green的研究表明，亲本AMP (FRLKFH)损害了细胞膜的完整性以及围绕dna的内核膜。这在图3中很明显，荧光报告蛋白集中在化学渗透的孢子和菌丝的细胞核(3A和3C)中，并且在AMP受损的细胞中均匀分散(3B和3D)。该技术已被应用于提供用于测试抗菌涂层(ProteCoat + UCAR 451)的高通量筛选，并提出了类似的机制。如前所述，将ProteCoat-UCAR混合物涂在96孔透明聚苯乙烯板的底部，然后用107孢子/ml的镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)接种。SYTOX Green的加入可以实时监测孢子的活力。该试验将评估涂层抗菌功效所需的时间缩短至3小时。随着涂层中ProteCoat浓度的增加，随着细胞渗透并允许SYTOX Green进入，荧光也会增加。在这个阶段，SYTOX Green被定位在细胞核中。在较高的肽浓度下，荧光降低约25%。这发生在核膜被破坏，染色体分散在细胞各处时(图4)。值得注意的是，抗菌涂层的效果相对较快;30min后的膜透性与3h后的膜透性无显著差异(比较不同ProteCoat浓度下30min和3hr bar)。 The MIC was determined to be between 1.6 mg/ml and 3.2 mg/ml, even though the coatings were challenged with 107 spores/ml, three logs more spores than in the growth studies. This level of spore challenge significantly exceeds the average ambient spore challenge (of 100 - 1,000 spores per cubic centimeter) by several orders of magnitude.
为什么涂料用ProteCoat™生物杀灭添加剂?
ProteCoat添加剂比目前用于涂料的传统生物杀灭/生物静态化学品具有显著的优势。它们是可生物降解的，在温和的条件下工作，是现有农药的安全替代品，并且与生产或向环境释放有害化合物无关。本文所述的抗菌素ProteCoat添加剂为解决某些被认为对环境或人类有害的现有生物杀菌剂的问题带来了一种新技术，提供了一种保护的机会，而不会像传统方法那样对人类健康和环境产生不利影响。同样重要的是ProteCoat肽基添加剂的适应性。自然界中发现的抗菌肽的多样性为为各种涂料定制新一代环境友好型抗菌添加剂提供了各种设计模板。抗菌肽组合库提供了丰富的候选杀菌剂，可适应特定的涂层要求。随着天然AMP数据库的快速增长和现有的重组DNA技术，目前存在的工具将允许AMP添加剂用于特定的涂层应用(例如建筑、技术论文、军事、国土安全、罐内、过程中、表面等)。
通过开发ProteCoat生物工程添加剂，对微生物表现出选择性毒性，并在广泛的抗菌谱上快速杀死微生物，Reactive Surfaces处于生物杀菌剂制造“绿色革命”的前沿。由于ProteCoat添加剂被设计为单独使用或与现有的生物杀菌剂协同工作，因此ProteCoat添加剂可以与其他生物杀菌剂集成使用，以增强其活性。这些“绿色”生物杀菌剂的大量潜在应用，包括住宅、医院、学校、政府设施、工业场所和公共交通系统的表面，将扩大ProteCoat添加剂可用于的涂料类型。开发具有成本效益的抗菌表面将减轻对建筑物居住者的危害，减少回收受污染空间所需的时间，并最大限度地减少与传统生物杀菌剂相关的环境影响。
如需更多信息，请致电512/472.8282联系Steve McDaniel，传真:512/472。8181，或电子邮件smcdaniel@reactivesurfaces.com。
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