粒子计数与分析
任何关于这个主题的讨论都必须从对“粒子”的确切含义的基本理解开始。为了本文的目的，我们将粒子定义为“微小的数量或碎片，某物相对较小的部分或数量”(韦氏词典)。科学家(或工程师)感兴趣的粒子的典型测量方法是粒径分布(粒子数)、尺寸、形状和单位体积的数量(稀释)。虽然频率(每单位体积的粒子数)一开始看起来相当简单，但它很容易因粒子重叠和粒子“聚集”而变得复杂。这个潜在的问题很容易解决，可以通过稀释主题物质来分离粒子，并将它们呈现在单个细胞层中，从而实现直接的“二元”分析(粒子要么存在，要么不存在)。然而，如何描述粒子的特性给我们提出了一个更加困难的问题。为了分析的目的，通常需要将粒径量化为一个“单一数字”，它可以与另一个变量(频率，稀释度，温度等)绘制在一个简单的图上。最简单的测量粒子大小的方法是它的直径，但由于粒子形状的变化，即使这也不像人们想象的那样简单。在一个完美的世界里，所有的粒子都应该是相同的形状，这样就可以用一个数字来量化大小。但在现实世界中，粒子表现出各种各样的形状，问题变成了如何描述粒子形状的分布。相当数量的研究和应用数学已经应用于这个问题，这超出了本文的范围。一般公认的行业粒度标准是计算其等效球径(ESD)。这就允许用一个数字来量化任何形状的粒子的大小。
虽然ESD是一种已知的、已建立的表征颗粒大小的方法，但许多应用还需要一些形状量化来区分样品中可能具有相等ESD的颗粒类型。如果总能获得只包含一种粒子的均匀样品，这就不是问题了。现实世界的问题通常包括分析在同一流体中包含多种不同颗粒类型的样本。一个相对容易确定的简单测量方法是粒子的纵横比，即其最大长度与最小长度之比。例如，具有相同ESD的两个粒子可能具有1:1的长弦比(球形)或大于1:1的长弦比(圆柱形)。由于样本中包含的两种不同粒子类型的纵横比可能不同，因此该测量是分离这两种粒子类型的一种简单方法，即使它们可能绘制相同的ESD。
其他的性质可以用来区分样品中的粒子。自动分析系统中使用的两个特性是光散射和荧光。光散射是粒子的光学特性的函数，并且在不同的材料和尺寸之间有所不同。188金宝搏bet官网光散射可以通过将激光对准样品并量化被样品粒子轻微偏转(前向散射)或散射到侧面(侧向散射)的光的数量来测量。荧光是粒子的化学成分的函数，也可以用来区分样品中的粒子。当粒子被窄波长光源(通常是激光)照射时，就会发生荧光。通过对粒子通过窄带滤波器发出的光进行分类，可以使用多个光电倍增管(pmt)来检测具有不同荧光发射的粒子。
在许多这类自动化系统中，调节pmt的电增益也可用于帮助缩小检测和分析的粒子类型。来自pmt的信号被用作电子系统的“触发器”，它决定何时对流体中经过的粒子进行采样和记录。这大大减少了需要分析的数据量，而不是在预设的时间间隔内连续采样。例如，在稀疏样品中，只有当具有所需性能的粒子存在时，而不是当“空液体”通过流腔时，才进行测量和记录，这大大减少了收集用于分析的数据量。
历史的方法
17世纪，首次使用显微镜来观察和记录微观生命，极大地改变了科学家们研究物体和现象的能力，而这些现象发生在肉眼无法观察到的水平之下。这在粒子分析中当然是正确的，甚至在今天显微镜仍然是用于这项活动的最常用的仪器。用于粒子分析的标准显微镜的主要缺点是需要时间，无论是样品制备，还是计数和测量粒子的性质。此外，由于样品制备和分析需要这段时间，显微镜一次只能观察一个静态样品。虽然这对于早期发现阶段的基础研究是可以的，但一旦需要详细查看过程，就不能接受了。首先，验证发现阶段中发现的因果关系的第二阶段需要分析统计上显著数量的被分析粒子。这个过程对于手工方法来说太耗时了，并且需要在测量中引入某种程度的自动化。其次，由于这是一个过程的分析，采样需要在过程的一段时间内完成。事实上，这些过程中有许多需要长期持续分析，一个极端的例子是为了质量控制而对过程中的粒子进行持续监测。当然，还需要其他方法来实现这些目标。科学家们为粒子计数和分析的自动化设计了各种方法和仪器，可以超越标准光学显微镜的限制。一些最早用于自动粒子计数的仪器是基于Coulter原理的，被称为“Coulter计数器”。其中许多至今仍在使用，因为它们允许快速定量的粒子频率和大小分布在异质样品。这些系统的主要缺点是它们是基于“coulter volume”的尺寸(因此不能区分粒子类型)，并且不提供任何关于粒子光学特性的信息
最近，流式细胞仪已广泛用于自动粒子分析。流式细胞仪测量粒子光散射和荧光。光散射引入了确定粒子的某种形态感的能力，而荧光有助于区分在相对较窄的波长中发出荧光或不发出荧光的粒子。流式细胞仪在相对均匀的样品粒径下工作得非常好，在ESD中通常在0.5到20微米范围内。然而，为了获得粒度相对均匀的样品，通常需要对样品的自然状态进行预处理。这些系统的另一个主要缺点是，它们使用鞘状流体装置，以便通过流腔产生样品的层流。鞘状流体装置相当复杂，需要更多的设置时间，颗粒尺寸限制在100微米以下，更换费用非常昂贵。
与这些正在开发的仪器并行使用的另一种方法是对流动中的颗粒进行简单成像。使用这种技术的早期研究使用摄影胶片和“触发”图像捕捉，使用闪光灯或快速快门来“冻结”流动中的粒子。随着计算机技术的发展，胶片已经被数字图像捕获硬件所取代。有了数字图像，就可以通过最初在遥感(侦察和测绘)和医学研究领域开发的易于理解的图像分析技术自动进行许多测量。在早期，尽管这些测量可以由计算机自动完成，但由于数字图像处理的计算机密集型特性，它们需要时间(非“实时”)。这限制了这些技术的使用，只有资金充足的实验室才能买得起非常强大的计算机或专门的图像处理硬件。运算速度的持续指数增长和计算硬件成本的降低，使得更多的科学家可以使用这种类型的图像分析。
一项新技术
Continuous-Imaging粒子分析
流体成像技术公司开发了一种新的流体颗粒分析仪器，称为FlowCAM®(流式细胞仪和显微镜)。该仪器结合了流式细胞仪和数字成像显微镜的功能。基本架构如图1所示。与流式细胞仪一样，其基本架构可以分为三个相互关联的子系统:流体系统，将所研究的流体输送到流腔中;包含光源、探测器和其他光学元件的光学系统;还有电子系统，它控制整个装置并对各种探测器收集到的图像和数据进行实际处理。
FlowCAM可以根据科学家的需要以各种不同的方式配置。在其最简单的配置中，连续成像，仪器只使用数字成像子系统来连续成像样品，因为样品流经流腔。样品的照明是通过电子触发一个闪光的LED光源和帧捕获器在预设的间隔完成的。然后计算机处理和存储图像到磁盘。为了节省存储空间，不存储整个图像字段。相反，通过在图像字段中的每个粒子周围创建一个“包围框”来生成子图像，并仅将粒子图像存储在磁盘上。在获取每个粒子图像时，计算关于粒子的数据，如长度、宽度、ESD、面积和纵横比，并将其存储到图像本身的索引中。
在FlowCAM的其他配置中，该仪器可以使用来自PMT的荧光或前向光散射电压作为触发机制，在样品流经流腔时收集数据和图像。本质上，这相当于一个流式细胞仪，根据科学家输入的参数(如尺寸、荧光或散射)选择图像捕获。与连续成像模式一样，PMT生成的每个触发器都会收集粒子的子图像，每个粒子的相关数据(大小、纵横比、荧光强度等)被存储到粒子图像的索引中。为每个图像收集的数据还包含成像视场内粒子的位置，这可以消除在粒子附着到流单元时可能收集到的冗余数据。
无论配置如何，来自样例流的数据都可以随着时间的推移不断收集，唯一的限制是处理器的速度和磁盘驱动器施加的数据存储的总体限制。这意味着该仪器不仅可以在实验室中用于分析离散样品，也可以用于现场连续监测过程。
一旦从样本或过程中收集到数据，它就可以以两种不同的模式呈现给科学家进行审查:图像拼贴或交互散点图。在图像拼贴模式中，科学家可以查看包含多个粒子的拼贴图像，以可视化地对粒子类型和形态进行分类在交互散点图模式中，数据以类似于流式细胞仪的方式呈现。在包含两个变量的图上显示二维粒子图。最简单的图可以是粒子ESD与荧光的对比，图上的每个点代表一个单一的粒子。还可以生成其他图，例如粒子大小与纵横比(这个图可以很容易地显示和区分样本中包含的两种不同类型的粒子)。一旦散点图显示出来，用户就可以通过在散点图上的特定粒子组周围定义一个框来与它进行交互。这将显示一个包含框内所有这些粒子的图像拼贴图(图2)。这在分离只包含异质样本中特定类型粒子的显示图像时非常有用。
与其他用于颗粒分析的仪器相比，FlowCAM有许多独特之处。首先，与传统的流式细胞仪不同，FlowCAM不使用鞘状流体硬件。这大大减少了设置和维护时间的使用，并允许广泛的颗粒尺寸的研究，1微米到3毫米之间使用不同大小的流池。其次，FlowCAM在物镜上使用了专利光学元件，以增加系统的聚焦深度。由于成像景深随物镜功率的增加而减小，因此增加的光学元件大大增加了成像的清晰度，使仪器能够在更高的放大率下成像。此外，增强的景深使它可以在比其他仪器更高的流速下使用(高达10毫升/秒)。如上所述，FlowCAM还可以用于流体流动的连续分析，而不只是其他方法的典型离散样本。最后，由于成像是FlowCAM的重要组成部分，因此可以很容易地实时计算长/宽(而不仅仅是ESD)、面积和纵横比等测量值，图像可用于视觉和计算后处理。
FlowCAM已经经过了广泛的测试，与传统的手动方法相比，它在许多参数上的性能得到了验证这些测试验证了景深增强光学对颗粒分级精度、颗粒分级和计数的准确性、基于粒度分布准确区分颗粒类型的能力以及连续监测样品流和检测样品含量变化的能力的贡献。
墨粉颗粒分析实例
在第一个例子中，客户想要在研究实验室和生产车间自动测量墨粉颗粒的大小分布。他们之前曾使用Coulter计数器进行分析，但对观察形状及其对碳粉性能的影响的可能性感兴趣。先前的技术一贯产生平均ESD结果约8微米为“好”的墨粉。通过FlowCAM处理一个样本，其总体结果如图3所示。与之前的结果一致，计算的平均ESD为8.21微米。然而，1.75微米的模态和实际直方图的形状清楚地表明了一个“双模态”分布。为了进一步研究这一点，使用FlowCAM交互散射图来观察分布的每个“峰值”下的粒子。在更小的ESD峰(在模式周围)中包含的粒子被证明不是碳粉粒子，而是碳粉混合物中的添加剂。客户端可以通过查看图像看到这一点，如图4所示。
此时的问题是，真正需要的平均ESD测量值是针对整个分布(包括添加剂)还是仅针对碳粉。客户只想知道碳粉颗粒的平均值。只需将软件中可接受的最小粒子ESD从1微米更改为3微米，就可以立即重新计算粒子统计量，结果如图5所示。
可以看到，当通过将最小可接受粒径提高到3微米而“剪掉”分布的下部时，平均ESD增加到11.34微米，模态跃迁到8.5微米。
虽然这是一个相对简单的示例，但它确实展示了使用成像执行分析的优势。客户端能够查看原始直方图的下峰值下的图像，并从视觉上确定其中包含的粒子是添加剂，而不是碳粉。通过将这些粒子从分布中剔除，得到了更准确的平均ESD值。在此应用中使用FlowCAM的额外好处是，客户现在可以使用图像来研究颗粒形状如何影响碳粉性能。
纤维涂层填料实例
在这个例子中，要研究的颗粒是纤维颗粒，用作隔音天花板瓷砖降噪涂层的填料。颗粒的长度并不是那么重要(由于制造过程的性质，颗粒的长度变化很大)，但每个颗粒的宽度对产品性能至关重要。客户先前分析颗粒的方法是使用光学显微镜，并配有操作人员测量颗粒的宽度。操作员平均需要15分钟才能得到一个测量100个粒子的粒子宽度的统计样本。由于处理每个样品需要大量的时间和专业知识，这种分析仅限于研发实验室，不能用于生产。由于FlowCAM使用数字图像进行测量，并可以测量每个粒子的长度和宽度，它被视为自动化分析的一个很好的潜在候选人，可能适用于研发和生产之外的领域。使用FlowCAM对这种材料的样本进行分析，典型结果如图6所示。该样品的平均ESD为14.09微米，而手动显微镜分析的测量结果显示平均宽度约为6微米。对于这种形状的粒子，ESD不能以有意义的方式表征粒子(特别是宽度的临界测量)。然而，如前所述，FlowCAM在计算ESD之前会测量每个粒子的长度和宽度。每个粒子的所有测量数据都包含在由FlowCAM软件生成的Excel电子表格中。通过使用内置的Excel工具绘制FlowCAM测量到的每个粒子的宽度与频率的关系，可以以类似于客户希望的方式绘制相同的结果，如图7所示。
这个宽度分布与手工创建的几乎完全相同，其平均值与手工测量的结果相差不超过0.1微米。FlowCAM能够在1分钟内处理5000多个颗粒，而使用之前的手工方法需要15分钟处理100个颗粒。这在较少的时间内产生了统计上更有效和可重复的结果，而不需要熟练的操作人员。对于这种特殊的过程，这意味着这些颗粒的分析可以在研发实验室中更频繁地执行，并具有实际应用于生产车间的潜力。再一次，通过查看粒子的图像，可以提供大量额外的见解，这导致了一些附加类型的粒子分析的建议，不仅可以应用于该涂层产品，还可以应用于该客户也生产的其他产品。
结论
一种新的分析仪器，FlowCAM，已经被开发出来，为涉及自动粒子分析的科学研究开辟了新的应用。FlowCAM中使用的技术的主要优点是能够分析连续流动，能够分析颗粒形状，最重要的是，可以获得颗粒的数字图像，并在后处理中进行进一步分析。由于FlowCAM架构的灵活性，它可以应用于粒子分析的各种应用，在仪器的能力和它可以解决的问题类型方面，未来都有潜在的增长。因此，该仪器对于涂料行业中与颗粒分析相关的科学家、研究人员、产品开发人员、QC和制造人员来说是一种真正的使能技术。188BET竞彩Lew Brown是流体成像技术市场部和销售部的经理。可致电207/882.1100或lew@fluidimaging.com．
参考文献
颗粒尺寸对涂料工业的重要性，第1部分:颗粒尺寸测量。188BET竞彩《色彩科学与技术进展》2002年1月第5卷第1期。2 Sieracki, C. K.;Sieracki m . e .;用于海洋浮游生物自动分析的流动成像系统。海洋生态学进展丛刊，1998年7月。
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